Demostración de Ribosome

La demostración de Ribosome es una técnica usada para funcionar en la evolución de la proteína vitro para crear proteínas que pueden ligar a ligand deseado. El proceso causa proteínas traducidas que tienen que ver con su progenitor mRNA que se usa, como un complejo, para ligar a ligand inmovilizado en un paso de selección. Los híbridos de la mRNA-proteína que ligan bien son entonces inversos transcrito a cDNA y su secuencia amplificada vía PCR. El resultado final es una secuencia nucleotide que puede ser usada para crear proteínas fuertemente obligatorias.

Ribosome muestran el proceso

La demostración de Ribosome comienza con una biblioteca ingenua de la codificación de secuencias del ADN para polipéptidos (Mattheakis, Bhatt y Dower (1994) un en vitro polialgún sistema de demostración para identificar ligands de bibliotecas del péptido muy grandes. Proc Natl Acad Sci los EE. UU 91, 9022-9026). Cada secuencia se transcribe, y luego se traduce en vitro en el polipéptido. Sin embargo, la codificación de la biblioteca del ADN para una biblioteca particular de proteínas obligatorias genéticamente se funde a una secuencia del espaciador que carece de una parada codon. Esta secuencia del espaciador, cuando traducido, todavía se ata al peptidyl tRNA y ocupa el túnel ribosomal, y así permite a la proteína de interés en sobresalir del ribosome y pliegue. Lo que resultados es un complejo de mRNA, ribosome, y proteína que puede ligar a ligand ligado a la superficie. Este complejo se estabiliza con la bajada de temperatura y la adición de cations como el Mg.

Durante la encuadernación subsecuente, o dejar por los suelos, etapas, el complejo se introduce en ligand ligado a la superficie. Esto se puede llevar a cabo varios caminos, por ejemplo usando una afinidad chromatography columna con una cama de resina que contiene ligand, unos 96 - bien plato con ligand ligado a la superficie inmovilizado o cuentas magnéticas que se han cubierto de ligand. Los complejos que ligan bien se inmovilizan. Elution subsecuente de las carpetas vía concentraciones de sal altas, chelating agentes o ligands móvil que el complejo con el adorno obligatorio de la proteína permite a la disolución del mRNA. El mRNA puede ser entonces la espalda transcrita inversa en cDNA, someterse a mutagenesis, e iterativamente alimentado en el proceso con la mayor presión selectiva para aislar aún mejores carpetas.

Ventajas de demostración de ribosome

Atando

al progenitor de la proteína al complejo, los procesos de la demostración de ribosome saltan la microserie/péptido bead/multiple-well separación de la secuencia que es común en ensayos que implican nucleotide hybridization y proporciona una manera lista de amplificar las proteínas que realmente ligan sin descifrar la secuencia hasta necesario. Al mismo tiempo, este método confía en la generación de fondos grandes, concentrados de la diversidad de la secuencia sin huecos e impedimento de estas secuencias degradar, hybridizing, y reaccionar el uno con el otro de modos que crearían huecos espaciales por la secuencia.

Los métodos competidores para la evolución de la proteína en vitro son la demostración de phage, la demostración de la levadura, la demostración bacteriana y la demostración de mRNA. Como se realiza completamente en vitro, hay dos ventajas principales a otras tecnologías de selección. En primer lugar, la diversidad de la biblioteca no es limitada por la eficacia de transformación de células bacterianas, pero sólo por el número de ribosomes y moléculas mRNA diferentes presentes en la probeta. En segundo lugar, las mutaciones arbitrarias se pueden introducir fácilmente después de cada selección por ahí, ya que ninguna biblioteca se debe transformar después de ningún paso de la variedad. Esto permite la evolución dirigida fácil de proteínas obligatorias sobre varias generaciones.

Un requisito previo para la selección de proteínas de bibliotecas es el enganche de genotipo (ARN, ADN) y fenotipo (proteína). En la demostración de ribosome, esta relación se lleva a cabo durante en la traducción vitro estabilizando el complejo que consiste en el ribosome, el mRNA y el polipéptido naciente, correctamente doblado. Los complejos ribosomal se permiten ligar al objetivo inmovilizado por la superficie. Mientras que los complejos no atados se quitan lavando, mRNA de los complejos que muestran un polipéptido obligatorio se puede recuperar, y así, la información genética de los polipéptidos obligatorios está disponible para el análisis.

Véase también



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