Proyección de dos híbridos

A. El gene del factor de transcripción de Gal4 produce dos proteína de la esfera (BD y d. C.), que es esencial para la transcripción del gene del reportero (LacZ).

B, C. Están preparadas dos proteínas de la fusión: Gal4BD+Bait y Gal4AD+Prey. Ninguno de ellos es por lo general suficiente para iniciar la transcripción (del gene del reportero) solo.

D. Cuando tanto las proteínas de la fusión se producen como la parte del Cebo del primer se relacionan con la parte de la Presa del segundo, la transcripción del gene del reportero ocurre.

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La proyección de dos híbridos (también conocido como la levadura sistema de dos híbridos o Y2H) es una técnica de la biología molecular usada para descubrir interacciones de la proteína de la proteína e interacciones del ADN de la proteína probando de interacciones físicas (como la encuadernación) entre dos proteínas o una proteína sola y una Molécula de ADN, respectivamente.

La premisa detrás de la prueba es la activación del gene (s) del reportero río abajo por la encuadernación de un factor de transcripción en una río arriba activación de secuencia (UAS). Para la proyección de dos híbridos, el factor de transcripción se parte en dos fragmentos separados, llamados la esfera obligatoria (BD) y activación de esfera (AD). El BD es la esfera responsable de ligar al UAS y d. C. es la esfera responsable de la activación de transcripción. El Y2H es así un ensayo de complementación del fragmento de la proteína.

Historia

Promovido por Stanley Fields y Canción en 1989, la técnica al principio se diseñó para descubrir interacciones de la proteína de la proteína usando el GAL4 transcriptional activator de la levadura Saccharomyces cerevisiae. La proteína GAL4 activó la transcripción de una proteína implicada en la utilización galactose, que formó la base de la selección. Desde entonces, el mismo principio se ha adaptado para describir muchos métodos alternativos incluso unos que descubren interacciones del ADN de la proteína, interacciones del ADN del ADN y usan Escherichia coli en vez de la levadura.

Premisa básica

La llave a la pantalla de dos híbridos es que en la mayor parte de factores de transcripción eucarióticos, la activación y las esferas obligatorias son modulares y pueden funcionar en la proximidad el uno del otro sin la encuadernación directa. Esto significa que aunque el factor de transcripción se parta en dos fragmentos, todavía puede activar la transcripción cuando los dos fragmentos indirectamente se relacionan.

El enfoque de proyección más común es la levadura ensayo de dos híbridos. Este sistema a menudo utiliza una tensión genéticamente tramada de la levadura en la cual la biosíntesis de ciertos nutrientes (por lo general aminoácidos o ácidos nucleicos) falta. Cuando cultivado en medios que carece de estos nutrientes, la levadura no puede sobrevivir. Esta tensión de la levadura del mutante se puede hacer incorporar el ADN extranjero a la forma de plasmids. En la levadura la proyección de dos híbridos, el cebo separado y la presa plasmids se introducen simultáneamente en la tensión de la levadura del mutante.

Plasmids se traman para producir un producto de la proteína en el cual la esfera que liga el ADN (BD) el fragmento se funde en una proteína mientras otro plasmid se trama para producir un producto de la proteína en el cual el fragmento de la esfera de activación (AD) se funde en otra proteína. La proteína fundida al BD se puede mencionar como la proteína del cebo y es típicamente una proteína conocida que el investigador usa para identificar a nuevos compañeros obligatorios. La proteína fundida a d. C. se puede mencionar como la proteína de la presa y puede ser una proteína conocida sola o una biblioteca de proteínas conocidas o desconocidas. En este contexto, una biblioteca puede consistir en una colección de secuencias que codifican la proteína que representan todas las proteínas expresadas en un organismo particular o tejido, o se pueden generar sintetizando secuencias del ADN arbitrarias. Sin tener en cuenta la fuente, se incorporan posteriormente en la secuencia que codifica la proteína de un plasmid, que es entonces transfected en las células elegidas para el método de proyección. Esta técnica, usando una biblioteca, supone que cada célula sea transfected sin más que un plasmid solo y que, por lo tanto, cada célula por último no expresa más que a un miembro solo de la biblioteca de la proteína.

Si el cebo y las proteínas de la presa se relacionan (es decir, ligue), entonces d. C. y BD del factor de transcripción indirectamente se relacionan, trayendo el d. C. en la proximidad del sitio del principio de transcripción y la transcripción del gene (s) del reportero puede ocurrir. Si las dos proteínas no se relacionan, no hay ninguna transcripción del gene del reportero. De esta manera, una interacción acertada entre la proteína fundida se une a un cambio del fenotipo de la célula.

El desafío de separar células que expresan proteínas que resultan relacionarse con sus proteínas de la fusión del equivalente de aquellos que no hacen, se dirige en la siguiente sección.

Esferas fijas

En cualquier estudio, algunas esferas de la proteína, aquellos bajo la investigación, se variarán según los objetivos del estudio mientras que otras esferas, aquellos que no investigan, se guardarán constantes. Por ejemplo en un estudio de dos híbridos para seleccionar esferas que ligan el ADN, la esfera que liga el ADN, BD, se variará mientras las dos proteínas que se relacionan, el cebo y presa, se deben guardar constantes para mantener una encuadernación fuerte entre el BD y d. C. Hay varias esferas de las cuales elegir el BD, cebo y presa y d. C., si éstos deben permanecer constantes. En investigaciones de interacción de la proteína de la proteína, el BD se puede elegir de cualquiera de muchas esferas fuertes que ligan el ADN como el Zif268. Una opción frecuente de cebo y esferas de la presa es residuos 263–352 de la levadura Gal11P con una mutación N342V y residuos 58–97 de la levadura Gal4, respectivamente. Estas esferas se pueden usar tanto en levadura - como en técnicas de selección bacterianas y se conocen ligar juntos fuertemente.

D. C. elegido debe ser capaz de activar la transcripción del gene del reportero, usando la propia maquinaria de transcripción de la célula. Así, la variedad de ANUNCIOS disponibles para el uso en técnicas basadas en la levadura puede no convenir al uso en sus análogos bacterianos. El herpes simple sacado del virus d. C., VP16 y levadura Gal4 d. C. se han usado con el éxito en la levadura mientras una parte del α-subunit de E. coli ARN polymerase se ha utilizado en métodos situados en coli E.

Mientras la activación importante de esferas puede permitir la mayor sensibilidad hacia interacciones más débiles, a la inversa, un más débil d. C. puede proporcionar la mayor severidad.

Construcción de expresión plasmids

Varias secuencias genéticas tramadas se deben incorporar en la célula del anfitrión para realizar el análisis de dos híbridos o una de sus técnicas derivadas. Las consideraciones y los métodos usados en la construcción y la entrega de estas secuencias se diferencian según las necesidades del ensayo y el organismo elegido como el fondo experimental.

Hay dos amplias categorías de la biblioteca híbrida: bibliotecas arbitrarias y bibliotecas situadas en cDNA. Una biblioteca cDNA es constituida por el cDNA producido a través de la transcripción inversa de mRNA coleccionado de células específicas de tipos de la célula. Esta biblioteca puede ser ligated en una construcción de modo que se ate al BD o d. C. usado en el ensayo. Una biblioteca arbitraria usa longitudes del ADN de la secuencia arbitraria en el lugar de estas secciones cDNA. Varios métodos existen para la producción de estas secuencias arbitrarias, incluso la cassette mutagenesis. Sin tener en cuenta la fuente de la biblioteca del ADN, es ligated en el lugar apropiado en plasmid/phagemid relevante utilización de la restricción apropiada endonucleases.

E. consideraciones coli-específicas

Colocando las proteínas híbridas bajo el control de IPTG-inducible lac promotores, sólo se expresan en medios complementados con IPTG. Adelante, por la inclusión de genes de resistencia antibióticos diferentes en cada construcción genética, el crecimiento de células no transformadas fácilmente se previene a través de la cultura en medios que contienen los antibióticos correspondientes. Esto es particularmente importante para métodos de selección contrarios en los cuales una carencia de la interacción es necesaria para la supervivencia de la célula.

El gene del reportero se puede insertar en el E. coli genoma insertándolo primero en un episome, un tipo de plasmid con la capacidad de incorporarse en el genoma de la célula bacteriano con un número de la copia de aproximadamente un por célula.

La expresión híbrida phagemids puede ser electroporated en E. coli XL-1 células Azules que después de amplificación e infección con el ayudante VCS-M13 phage, cederá una reserva de biblioteca phage. Estos phage contendrán cada uno a un miembro de un solo hilo de la biblioteca phagemid.

Recuperación de información de la proteína

Una vez que la selección se ha realizado, la estructura primaria de las proteínas que muestran las características apropiadas se debe determinar. Esto es conseguido por la recuperación de las secuencias que codifican la proteína (como al principio insertado) de las células mostrando el fenotipo apropiado.

E. coli

El phagemid solía transformar E. coli las células se pueden "rescatar" de las células seleccionadas infectándolos con el ayudante VCS-M13 phage. Las partículas phage que resultan que se producen contienen phagemids de un solo hilo y son usadas para infectar células Azules XL-1. Phagemids dos veces varados se coleccionan posteriormente de estas células Azules XL-1, esencialmente invertir el proceso solía producir la biblioteca original phage. Finalmente, las secuencias del ADN se determinan a través de dideoxy sequencing.

Control de sensibilidad

El Escherichia Tet-R repressor coli-sacado se puede usar de acuerdo con un gene del reportero convencional y puede ser controlado por tetracycline o doxicycline (inhibidores de Tet-R). Así la expresión de Tet-R es controlada por el sistema de dos híbridos estándar pero el Tet-R por su parte controla (reprime) la expresión de un reportero antes mencionado como el HIS3, a través de su promotor Tet-R. Tetracycline o sus derivados pueden ser usados entonces para regular la sensibilidad de un sistema que utiliza Tet-R.

La sensibilidad también se puede controlar variando la dependencia de las células en sus genes del reportero. Por ejemplo, esto efectuado cambiando la concentración de histidine en el medio de crecimiento para células his3-dependientes y cambiando la concentración de estreptomicina para células dependientes aadA. La dependencia de genes de la selección también se puede controlar aplicando un inhibidor del gene de selección en una concentración conveniente. 3 Amino 1,2,4 triazole (3 - EN) por ejemplo, es un inhibidor competitivo del producto HIS3-gene y puede estar acostumbrado a titrate el nivel mínimo de la expresión HIS3 requerida para el crecimiento en medios histidine-deficientes.

La sensibilidad también se puede modular variando el número de secuencias del operador en el ADN del reportero.

Proteínas de la no fusión

Un tercero, la proteína de la no fusión se puede co-expresar con dos proteínas de la fusión. Según la investigación, la tercera proteína puede modificar una de las proteínas de la fusión o mediar o interferir con su interacción.

La co-expresión de la tercera proteína puede ser necesaria para modificación o activación de una o ambos de las proteínas de la fusión. Por ejemplo el S. cerevisiae no posee ningún tyrosine endógeno kinase. Si una investigación implica una proteína que requiere tyrosine phosphorylation, el kinase se debe suministrar en la forma de un tyrosine kinase gene.

La proteína de la no fusión puede mediar la interacción ligando ambas proteínas de la fusión simultáneamente, como en caso del receptor ligand-dependiente dimerization.

Para una proteína con un compañero que se relaciona, su homología funcional a otras proteínas se puede tasar suministrando la tercera proteína en la forma de la no fusión, que entonces puede o puede no competir con la proteína de la fusión por su compañero obligatorio. La encuadernación entre la tercera proteína y la otra proteína de la fusión interrumpirá la formación del complejo de activación de la expresión del reportero y así reducirá la expresión del reportero, llevando al cambio discernidor del fenotipo.

Levadura de hendidura-ubiquitin de dos híbridos

Una limitación de la levadura clásica que las pantallas de dos híbridos son que se limitan con proteínas solubles. Es por lo tanto imposible usarlos para estudiar las interacciones de la proteína de la proteína entre proteínas de la membrana integrales insolubles. El sistema de hendidura-ubiquitin proporciona un método a vencer esta limitación. En el sistema de hendidura-ubiquitin, dos proteínas de la membrana integrales para estudiarse se funden a dos mitades ubiquitin diferentes: un C-terminal ubiquitin mitad ("Pequeño", residuos 35–76) y un N-terminal ubiquitin mitad ("Meollo", residuos 1–34). Estas proteínas fundidas se llaman el cebo y presa, respectivamente. Además de fundir a una proteína de la membrana integral, la mitad del Pequeño también se funde a un factor de transcripción (TF) que se puede hender lejos por el ubiquitin específico proembroma. Sobre la interacción de la presa del cebo, Meollo y mitades del Pequeño se reúnen, reconstituyendo la hendidura-ubiquitin. La molécula de hendidura-ubiquitin reconstituida se reconoce por el ubiquitin específico proembroma, que se parten de la proteína del reportero, permitiéndola inducir la transcripción de genes del reportero.

Un - tres - y variantes un-dos-híbridas

Un híbrido

La variación de un híbrido de esta técnica se diseña para investigar interacciones del ADN de la proteína y usa una proteína de la fusión sola en la cual d. C. se une directamente a la esfera obligatoria. La esfera obligatoria en este caso sin embargo es no necesariamente de la secuencia fija como en el análisis de la proteína de la proteína de dos híbridos, pero puede ser constituida por una biblioteca. Esta biblioteca se puede seleccionar contra la secuencia objetivo deseada, que se inserta en la región del promotor de la construcción de genes del reportero. En un sistema de selección positiva, una esfera obligatoria que con éxito liga el UAS y permite la transcripción así se selecciona.

Note que la selección de esferas que ligan el ADN no necesariamente se realiza usando un sistema de un híbrido, pero también se puede realizar usando un sistema de dos híbridos en el cual la esfera obligatoria se varía y el cebo y las proteínas de la presa se guardan constantes.

De tres híbridos

Las interacciones de la proteína del ARN se han investigado a través de una variación de tres híbridos de la técnica de dos híbridos. En este caso, una molécula del ARN híbrida sirve para lindar juntos con las dos esferas de la fusión de la proteína — que no se quieren para relacionarse el uno con el otro, pero mejor dicho la molécula del ARN intermediaria (a través de sus esferas que ligan el ARN). Las técnicas que implican proteínas de la no fusión que realizan una función similar, como descrito en la 'sección de las proteínas de la no fusión encima, también se pueden mencionar como métodos de tres híbridos.

Un-dos-híbrido

El uso simultáneo del un - y métodos de dos híbridos (es decir proteína de la proteína simultánea e interacción del ADN de la proteína) se conoce como un enfoque un-dos-híbrido y se espera aumentar la severidad de la pantalla.

Organismo del anfitrión

Aunque teóricamente, cualquier célula viva se pudiera usar como el fondo a un análisis de dos híbridos, hay consideraciones prácticas que dictan que se elige. La línea celular elegida debería ser relativamente barata y fácil a la cultura y suficientemente robusta para resistir la aplicación de los métodos investigadores y reactivo.

Levadura

S. el cerevisiae era el organismo modelo usado durante el inicio de la técnica de dos híbridos. Tiene varias características que lo hacen un organismo robusto para recibir la interacción, incluso la capacidad de formar estructuras de la proteína terciarias, pH interno neutro, realzó la capacidad de formar obligaciones disulfide y estado reducido glutathione entre otros factores del parachoques de cytosolic, mantener un ambiente interno hospitalario. El modelo de la levadura se puede manipular a través de técnicas no moleculares y su secuencia del genoma completa se conoce. Los sistemas de la levadura son tolerantes de condiciones de la cultura diversas y productos químicos ásperos que no se podían aplicar a culturas del tejido mamíferas.

Varias tensiones de la levadura se han creado expresamente para pantallas de Y2H, p.ej. Y187 y AH109, ambos producidos por Clontech.

Las proteínas de tan sólo ocho a tan grande como 750 aminoácidos se han estudiado usando la levadura.

E. coli

E. los métodos situados en coli tienen varias características que los pueden hacer preferibles para homologues basado en la levadura. La eficacia de transformación más alta y el precio más rápido del crecimiento prestan E. coli al uso de bibliotecas más grandes (superior a 10). Un precio positivo falso bajo de aproximadamente 3x10, la ausencia de requisito para una localización nuclear hace señas para incluirse en la secuencia de la proteína y la capacidad de estudiar proteínas que serían tóxicas a la levadura también puede ser factores principales para considerar eligiendo un organismo de fondo experimental.

Puede ser de la nota que la actividad methylation de cierto E. coli ADN methyltransferase proteínas puede interferir con algunas selecciones de la proteína que ligan el ADN. Si esto se espera, el uso de un E. coli tensión que es defectuosa para methyltransferase particular puede ser una solución obvia.

Aplicaciones

Determinación de secuencias cruciales para interacción

Cambiando aminoácidos específicos transformando los pares de bases del ADN correspondientes en el plasmids usado, la importancia de aquellos residuos del aminoácido en el mantenimiento de la interacción se puede determinar.

Después de usar el método basado en la célula bacteriano de seleccionar proteínas que ligan el ADN, es necesario comprobar la precisión de estas esferas como hay un límite al grado al cual el genoma de la célula bacteriano puede servir de un fregadero para esferas con una afinidad para otras secuencias (o en efecto, una afinidad general para el ADN).

Medicina y descubrimiento del veneno

La proteína de la proteína interacciones de señales plantea objetivos terapéuticos convenientes debido a su precisión y penetrante. El descubrimiento de la medicina arbitrario se acerca a bancos del compuesto de usos que comprenden estructuras químicas arbitrarias, y requiere un método de rendimiento alto de probar estas estructuras en su objetivo intencionado.

La célula elegida para la investigación se puede expresamente tramar para reflejar el aspecto molecular que el investigador tiene la intención de estudiar y luego solía identificar a nuevo humano o terapéutica de animal o agentes del antiparásito.

Determinación de función de la proteína

Por la determinación de los compañeros de interacción de proteínas desconocidas, las funciones posibles de estas nuevas proteínas se pueden deducir. Esto se puede hacer usando una proteína conocida sola contra una biblioteca de proteínas desconocidas o a la inversa, seleccionando de una biblioteca de proteínas conocidas usando una proteína sola de la función desconocida.

Selección de la proteína del dedo de zinc

Para seleccionar proteínas del dedo de zinc (ZFPs) para la ingeniería de la proteína, los métodos adaptados de la técnica de proyección de dos híbridos se han usado con el éxito. Un ZFP es una proteína que liga el ADN usada en la construcción de esferas de encargo que ligan el ADN que ligan a una secuencia del ADN deseada.

Usando un gene de selección con la secuencia objetivo deseada incluida en el UAS y aleatorizando las secuencias de aminoácidos relevantes para producir una biblioteca ZFP, las células que reciben una interacción del ADN-ZFP con las características requeridas se pueden seleccionar. Cada ZFP típicamente reconoce sólo 3-4 pares de bases, por tanto para prevenir el reconocimiento de sitios fuera del UAS, ZFP aleatorio se trama en un 'andamio' que consiste en más dos ZFPs de la secuencia constante. El UAS así se diseña para incluir la secuencia objetivo del andamio constante además de la secuencia para la cual un ZFP se selecciona.

Varias otras esferas que ligan el ADN también se pueden investigar usando este sistema.

Fuerzas

Debilidades

Cada uno de estos puntos solos puede dar ocasión a resultados falsos. Debido a los efectos combinados de toda la levadura de la fuente de error de dos híbridos se tienen que interpretar con la precaución. La probabilidad de generar positives falso significa que todas las interacciones deberían ser confirmadas por un ensayo de confianza alto, por ejemplo co-immunoprecipitation de las proteínas endógenas, que es difícil para datos de interacción de la proteína de la proteína a grandes escala. O bien, los datos de Y2H se pueden verificar usando variantes Y2H múltiples o técnicas bioinformatics. La prueba última si las proteínas que se relacionan se expresan al mismo tiempo, comparte algunos rasgos comunes (como anotaciones de la ontología de genes o ciertas topologías de la red), tiene interacciones homólogas en otras especies.

Véase también

Enlaces externos



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